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Napoli 31 marzo 2022 Università degli Studi di Napoli Federico II, Via Sergio Pansini 5 Edificio 12 – Aula Grande

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I danni alla cartilagine non guariscono spontaneamente, portando a una progressiva compromissione della struttura e delle funzioni dell’articolazione. La cartilagine articolare è un tessuto ialino che ricopre le estremità ossee articolari per consentire la libertà dei movimenti, nonché il carico e la distribuzione dei pesi. La sua capacità di autoriparazione è scarsa se non nulla, ed ha come unico risultato la formazione di un tessuto cicatriziale fibroso con caratteristiche meccaniche e biochimiche inferiori rispetto al tessuto nativo. Di conseguenza, i tessuti articolari tendono a deteriorarsi con il successivo sviluppo di malattie croniche invalidanti, come l’artrosi (OA). Il menisco è una struttura di fibrocartilagine addetta all’assorbimento degli urti e ad ammortizzare le sollecitazioni a cui è sottoposto il ginocchio. Solo la porzione vascolare periferica ha un potenziale di autoguarigione, mentre la regione avascolare interna ha una bassa capacità di rigenerazione. Se non trattate, le lesioni della cartilagine e meniscali peggiorano la qualità della vita e la capacità lavorativa dei pazienti, causando costi enormi per i sistemi di assistenza sanitaria e sociale. Pertanto, nel corso degli anni sono state proposte diverse opzioni per curare i danni alla cartilagine, sebbene rappresentino ancora una sfida per l’ortopedia.

Le cure palliative, utilizzando antidolorifici (analgesici) o farmaci antinfiammatori, possono solo alleviare i sintomi senza risolvere definitivamente le cause coinvolte nell’insorgenza della malattia e nella progressione della stessa. Le attuali strategie riparative sono in grado di colmare il difetto, ma il tessuto neoformato ha principalmente caratteristiche fibrose, favorendo quindi lo sviluppo di Osteoartrosi e rendendo quindi necessaria dopo alcuni anni l’impianto di una protesi articolare. Approcci rigenerativi tra cui l’innesto osteocondrale (autologo o allogenico) e autologo, cioè l’impianto di condrociti (ACI), ha lo scopo di rigenerare il tessuto cartilagineo con struttura e caratteristiche funzionali equivalenti alla cartilagine nativa. Nonostante i risultati incoraggianti ottenuti, queste procedure mostrano ancora carenze non trascurabili quali: morbilità del sito donatore e il fallimento dell’innesto a causa della morte periferica dei condrociti nel caso dell’innesto osteocondrale ; disponibilità dell’impianto e integrità biomeccanica, cellule a bassa vitalità e rischio di trasmissione della malattia per gli allotrapianti; perdita di cellule nello spazio articolare e perdita di fenotipo condrogenico nel caso della tecnica ACI di prima generazione che utilizza condrociti espansi; la necessità di due interventi, tempi di ritardo e aumento dei costi per l’ACI basata su scaffold. Per quanto riguarda il menisco, le lesioni tissutali possono essere trattate con trattamenti non operativamente o chirurgicamente tramite procedure come la meniscectomia parziale o totale. Tuttavia, in entrambi gli interventi è stato dimostrato che i condili femorali e il plateau tibiale sono esposti ad un’eccessiva usura, predisponendo in tal modo l’articolazione all’OA. Anche i tentativi di sostituire il menisco con innesti cadaverici (allotrapianti) presentano svantaggi: limitato disponibilità dell’innesto, possibile trasmissione di agenti patogeni, rigetto immunitario e discrepanza anatomica.

Negli ultimi decenni, l’ingegneria dei tessuti, intesa come combinazione di scaffold, cellule e /o fattori solubili/meccanici, è emersa come una strategia promettente per la riparazione e la rigenerazione della cartilagine. L’uso di scaffold arricchiti da condrociti è risultato efficace nel trattamento di difetti condrali e osteocondrali e lesioni osteoartriche precoci, riportando buoni risultati clinici in termini di guarigione dei tessuti, anche se sono ancora presenti problemi dovuti alla disponibilità limitata delle cellule e ai costi elevati per il processo di potenziamento della tecnica. Basato su questi limiti, le ricerche hanno anche considerato cellule alternative, come le cellule staminali mesenchimali (MSC), caratterizzate da un alto tasso di proliferazione e capacità di autorinnovarsi e differenziarsi in diversi fenotipi, incluso quello condrogenico. È importante sottolineare che le MSC non esprimono molecole del complesso maggiore di istocompatibilità di classe II, essenziali per il rigetto immunitario, che suggeriscono la possibilità di un uso allogenico. Di recente, i progressi tecnologici hanno consentito l’uso dell’intera nicchia del midollo osseo composta da MSC e cellule accessorie evitando manipolazioni di laboratorio.

Quindi molti gruppi di ricerca stanno focalizzando la loro attenzione su quella che può essere l’interazione tra scaffold e cellule staminali nella formazione di strutture potenzialmente impiantabili e capaci di riparare le lesioni nel modo più congeniale possibile. Tenendo conto del progressivo e importante sviluppo della stampa 3D e nello sviluppo della medicina personalizzata, ci si chiede se è possibile realizzare dei “patient specific” scaffold in grado di poter offrire i migliori outcome clinici e terapeutici possibili.

La biostampante 3D è un metodo nuovo e innovativo per la fabbricazione 3D di tessuti viventi /strutture organo similari attraverso la deposizione di piccole unità di una sostanza definita come “bioink”. Sono stati recentemente sviluppati due principali tipi di bioink: scaffold-based e scaffold free. Il primo tipo è composto da cellule e biomateriali che vengono rilasciati insieme per produrre un costrutto. Il materiale funge da supporto strutturale o impalcatura che crea un ambiente adatto alla crescita cellulare e alla differenziazione [2,16]. Quest’ultimo tipo è caratterizzato da aggregati come pallottole di cellule, fili di tessuto o sferoidi che secernono strutture simili a matrice extracellulare (ECM) che tengono insieme la componente cellulare. L’approccio scaffold-based è il primo e il più comune, ma entrambi i metodi mostrano vantaggi e limitazioni ed è stato suggerito che possono completarsi a vicenda per aiutare a coprire l’ampio spettro di applicazioni di ingegneria dei tessuti e della medicina rigenerativa [18]. Qui sono presentati nuovi sviluppi riguardanti l’approccio scaffold based applicato nell’ingegneria dei tessuti cartilaginei, utilizzando le cellule staminali come parte vivente.

La tecnica

La biostampa 3d scaffold-based è un tipo di “produzione stratificata” attraverso la quale vengono costruiti oggetti mediante l’aggiunta di strati successivi sovrapposti. Di conseguenza, i costrutti sono composti dal basso verso l’alto [16]. Al contrario, i “metodi sottrattivi” convenzionali rimuovono i materiali da un blocco inziale e generalmente costruiscono dall’alto verso il basso. Il preparato cellulare solo in un secondo momento viene coltivato sullo scaffold terminato (Figura 1a). Nonostante molti sforzi e miglioramenti, come la coltura dinamico con bioreattori [19], gli approcci convenzionali implicano ancora problemi, a causa della distribuzione casuale delle cellule all’interno dell’impalcatura e, in particolare, alla bassa densità nella parte interna dove le cellule tendono a morire anche a causa della scarsa concentrazione di nutrienti in quella zona [19]. La biostampa, a causa della natura intrinseca della tecnica, mostra il vantaggio di un fine controllo della distribuzione dello spazio cellulare, in termini di omogeneità, e di composizione e architettura dei costrutti mediante supporto di una buona vitalità cellulare (Figura 1b). In particolare, la migliore possibilità di modulare la meccanica e le proprietà chimiche consentono una migliore mimica delle caratteristiche dei tessuti della cartilagine naturale e della loro creazione di strutture complesse, come il compartimento osteocondrale [2]. Ulteriori vantaggi di questa tecnica includono i ridotti tempi di produzione, una maggiore versatilità e la possibilità di lavorare in ambienti chiusi con monitoraggio della temperatura e “senza solventi”. Il processo della biostampa, infatti, si basa sulla deposizione di goccioline cariche di cellule o di inclusione di cellule in un idrogel. Pertanto, nella maggior parte dei casi la tecnica non richiede l’uso di solventi tossici o nocivi per le cellule, sfruttando le caratteristiche di gel a base d’acqua come bioink [16]. È importante sottolineare che la biostampa 3D appartiene a un gruppo di tecniche, noto come “prototipazione rapida”, che consente la creazione di oggetti combinando il disegno tecnico assistito (CAD) con produzione assistita da computer (CAM). Di recente, la fabbricazione di prodotti su misura basati sulle immagini mediche del paziente acquisite con tecniche non invasive come la Risonanza Magnetica (MRI) e la tomografia computerizzata (TC) sono divenuti realizzabili [2,16]. Tali opzioni, migliorano la congruenza tra la dimensione dell’impianto e il difetto, può ridurre il tempo necessario per la chirurgia e il recupero del paziente e influire positivamente sul successo del trattamento. In generale, la possibilità di personalizzare la terapia, nota anche come medicina personalizzata, è promettente per migliorare l’assistenza sanitaria e, allo stesso tempo contenere i costi [20].

Ad oggi, le tecnologie di biostampa 3D scaffold-based più utilizzate si basano su getti, estrusione, e tecnologia laser (Figura 1b).

La bioprinting 3D basata sul getto può essere eseguita o come deposizione a getto d’inchiostro continua o goccioline singole con una distribuzione specifica (drop-on-demand). Solo quest’ultimo approccio è considerato idoneo, poiché il primo richiede un inchiostro conduttivo [14]. La tecnica drop-on-demand si basa su tre diversi meccanismi per generare goccioline: piezoelettrico, termico ed elettrostatico. I vantaggi di questa tecnica sono: bassi costi dovuti alla somiglianza con le stampanti commerciali, alta velocità di stampa come una conseguenza della capacità delle testine di stampa di supportare la modalità di lavoro in parallelo e l’elevata vitalità delle celle (80-90%). Gli svantaggi sono rappresentati dalla limitata selettività del materiale e dall’intasamento frequente della testina di stampa [16]. Per superare i problemi esistenti e ottenere prestazioni migliori sono state sviluppate tecniche ibride di stampa cellulare. Il gruppo di Graham ha scoperto un approccio di biostampa che permette di integrare la metodologia esistente per la stampa acquosa di goccioline in olio. In particolare loro erano in grado di stampare scaffold di cellule staminali ovine immerse in olio e successivamente sono stati incapsulati in un sottile strato di gel per il loro successivo trasferimento in un mezzo acquoso. Le cellule incorporate hanno mostrato un alta vitalità (media> 95%), capacità di proliferazione e capacità di produrre un ECM simile alla cartilagine sotto effetto della stimolazione del fattore di crescita 3 (TGF-3) [21].

La biostampa 3D basata sull’estrusione è già stata utilizzata per fabbricare scaffold eterogenei per la rigenerazione osteocondrale. La maggior parte delle biostampanti commerciali esistenti si basano su questa tecnologia, che è in grado di erogare filamenti continui di bioink attraverso un microugello mediante pistone o pressione pneumatica. I vantaggi di questa tecnica includono il rilascio di bioink altamente viscosi con il microugello, l’uso di polimeri sintetici, una produzione scalabile e un’elevata vitalità cellulare. I principali svantaggi sono una risoluzione e una deformazione relativamente basse e l’apoptosi delle celle incapsulate a causa della grande pressione generata lungo l’ugello dall’estrusione meccanica [14,16].

La biostampa 3D basata su laser è una tecnica costosa e complessa che utilizza energia laser pulsata per trasferire materiali su un substrato ricevente. Gli impulsi laser sono mirati su uno strato d’oro di un nastro, creando una bolla ad alta pressione, che guida il bioink verso un substrato. Questa procedura è senza ugelli, e quindi non ha problemi di intasamento con cellule o materiali. Nonostante questo la tecnica è in grado di produrre schemi di risoluzione più elevati, con conseguente riduzione della vitalità cellulare ai meccanismi a getto d’inchiostro [14].

Caratteristiche dei bioink.

Le proprietà dei bioink sono fondamentali per lo sviluppo di tessuti viventi funzionali mediante la biostampa 3D. I bioink basati sulla combinazione di scaffold e cellule dovrebbero soddisfare sia caratteristiche biologiche che biomateriali. Inoltre, per imitare la cartilagine, sono richieste funzionalità specifiche che rispecchino le caratteristiche anatomiche, funzionali e meccaniche di tale tessuto.

Caratteristiche Biomateriali

La stampabilità, la bioriassorbibilità e la biodegradabilità per i biomateriali sono requisiti fondamentali per garantire un buon risultato della procedura. La stampabilità è definita come la capacità di formare una struttura 3D come progettato dai dati CAD. Ciò è generalmente caratterizzato dalla tensione superficiale, viscosità, assottigliamento e reticolazione [22,23]. La regolazione della tensione superficiale, aumentando l’idrofobicità del bioink o stabilendo un’interazione elettrostatica con la superficie ricevente, può aumentare l’adesione del costrutto in aumento alla superficie di stampa, evitando qualsiasi deformazione o movimento indesiderato [24]. La viscosità deve essere regolata per ridurre l’occlusione della testina della stampante permettendo così un flusso di stampa in fase liquida, verticale, ininterrotto e sostenendo così il peso degli strati sovrapposti della struttura risultante [14]. La Bioriassorbibilità e la biodegradabilità sono altre proprietà critiche che consentono il degrado dell’impalcatura all’interno del sito di impianto alla stessa velocità di colonizzazione cellulare [36].Altre importanti caratteristiche dei bioink includono: alta risoluzione, basso costo, riproducibilità industriale, breve tempo per lamaturazione post-stampa e, nel caso degli idrogel, gelificazione rapida e assenza di variazioni di volume durante la gelificazione.

Caratteristiche Biologiche

La biocompatibilità con i sistemi viventi è una caratteristica di base comune non solo per un bioink, ma anche per tutti i biomateriali utilizzati nell’ingegneria dei tessuti. Altre importanti “non proprietà” biologiche dei materiali è che devono essere atossici, non immunogenici, non trombogenici e non cancerogeni [37]. La citocompatibilità consente di preservare le caratteristiche biologiche delle cellule incapsulate in termini di vitalità, proliferazione, funzione e produzione di ECM. In generale, viene implementata l’integrità cellulare utilizzando materiali idrosolubili, come gli idrogel, che sono permeabili all’ossigeno gassoso, ai nutrienti, e ai prodotti catabolici [36,37]. La bio-inerzia dovrebbe essere regolata poiché potrebbe non solo influenzare negativamente la capacità cellulare di proliferare e muoversi all’interno del bioink, ma anche provocare la morte attraverso anoikis (apoptosi indotta per distacco di cellule dall’ECM) [38]. Per superare questo problema, è stata sviluppata una miscela di un idrogel di acido ialuronico (HA) con destrano con caratteristiche di adesione proteica potenziata. Ciò ha comportato una maggiore vitalità delle cellule staminali biostampate derivate del tessuto adiposo [14].

Caratteristiche dell’ingegnerizzazione del tessuto cartilagineo

La capacità di rigenerazione è cruciale per le applicazioni di ingegneria del tessuto cartilagineo. In particolare, la neo-sintesi della matrice extracellulare cartilaginea può essere indotta da cellule staminali adeguatamente stimolate da specifici fattori solubili assorbiti all’interno del bioink, come TGF-1 e proteina morfogenetica ossea-6 (BMP-6) o aggiunti al terreno di coltura, come TGF-3, piruvato di sodio, desametasone, insulina, transferrina, acido selenico e ascorbato-2 fosfato (mezzo condrogenico) [14]. È stato dimostrato che le cellule staminali umane di derivazione adiposa incorporate in idrogel a base di gelatina e coltivate in presenza di un mezzo condrogenico hanno prodotto un ECM con caratteristiche tipiche cartilaginee [39]. I fattori solubili possono anche essere utilizzati per innescare fenotipi zonali specifici che sono tipici, ad esempio, del compartimento osteocondrale o meniscale. Romanazzo et al. sono stati in grado di riprodurre le due regioni meniscali mediante la biostampa di cellule staminali derivate da tampone di grasso infrapatellare con idrogel di alginato. Nello studio hanno utilizzato due diversi fattori di crescita nelle due diverse zone: TGF-3 per indurre la sintesi di collagene tipo II e glicosaminoglicani solfati, tipici della regione interna (avascolare / aneurale),e fattore di crescita del tessuto connettivo (CTGF) per indurre una caratteristica del fenotipo più fibrogenico della regione esterna (vascolare / neurale) [40].Le caratteristiche meccaniche dei costrutti biostampati sono inferiori rispetto a quelle del tessuto nativo. Per gli idrogel, ciò è dovuto principalmente all’allineamento casuale delle fibre e all’alto contenuto di acqua [37]. Diverse strategie possono essere applicate per rafforzare le prestazioni meccaniche quali: l’integrazione con particelle minerali (ad es. idrossiapatite) e cross-linking.

Per ottenere costrutti meccanicamente più stabili e robusti, è stata effettuata doppia stampa con PCL termoplastico. I gel a doppia stampa sono caratterizzati da due tipi di componenti con opposto nature fisiche; il minore è morbido e il maggiore è duro. Questo li rende unici, dal momento che acquisiscono maggiore resistenza meccanica e tenacità, mantenendo comunque un elevato contenuto di acqua. Ad esempio, in un modello suino sono stati in grado di riprodurre la rigidità dinamica del menisco [41,42].

Bioink: opzioni attuali

In genere, le opzioni di scaffold disponibili per i bioink sono idrogel, ECM decellularizzato (dECM), o microcarrier.

Gli idrogel

Gli idrogel sono i bioink più comunemente usati per il loro turgore e la loro lubrificazione, caratteristiche che meglio corrispondono alle proprietà della cartilagine e al loro potenziale di indurre le cellule verso un fenotipo condrogenico [43,44]. Sono colloidi idrofili semiliquidi composti da una rete di catene polimeriche reticolate naturali o sintetiche. La consistenza del gel consente di ottenere le forme desiderate e una miscelazione uniforme con cellule e fattori di crescita. L’alta porosità aiuta la diffusione delle cellule, ma ha scarse proprietà meccaniche non riuscendo a riprodurre la caratteristica biologica di cartilagine senza funzionalità adeguata [14,24,45]. Altri svantaggi degli idrogel sono i tempi critici limitati della gelificazione: specifici abbinamenti di densità media dei materiali e liquido e bassa risoluzione [7,44,45]. A seconda della loro origine, gli idrogel possono essere naturali o sintetici. Idrogel naturali utilizzati per l’ingegneria tissutale della cartilagine comprendono agarosio e alginato, collageni e gelatine, HA, chitosano, gomma di gellano, proteine della seta di fibrina, cellulosa e fibrina [16], che mostrano una buona biocompatibilità e biodegradabilità [45,46]. L’agarosio, un polisaccaride marino ottenuto da alghe, è uno dei primi idrogel sviluppati per applicazioni di ingegneria tissutale della cartilagine. Ciò è dovuto a caratteristiche specifiche come la facile gelazione, eccellente biocompatibilità, capacità di supportare la condrogenesi delle MSC e rigidità e viscoelasticità simile alla cartilagine nativa [47,48].I collageni, i principali componenti proteici della cartilagine naturale, hanno un uso documentato come componenti di scaffold per ingegneria tissutale della cartilagine [2]. Idrogel a base di collagene, hanno dimostrato grande biocompatibilità e biodegradazione senza causare infiammazione, in più favoriscono l’adesione e la condrogenesi delle MSC [51–53]. Un problema importante è rappresentato dalle povere proprietà meccaniche, che tuttavia possono essere superate mediante reticolazione [54,55]. L’HA è un glicosaminoglicano anionico non solfato presente nell’ECM cartilagineo, nel fluido sinoviale e nelle nicchie di cellule staminali, dove permette l’attacco cellulare attraverso recettori di superficie come CD44 [2,59]. È stato ampiamente utilizzato nelle applicazioni di ingegneria dei tessuti per promuovere la formazione della cartilagine [60,61]. Recenti studi preclinici in vitro e in vivo hanno dimostrato la possibilità di creare bioink a base di HA per cui le cellule staminali incorporate sono in grado di mantenere la loro multipotenza [62] e, soprattutto, può differenziarsi verso il fenotipo condrogenico [63,64].

La gomma di Gellan è un polisaccaride microbico anionico già utilizzato nel settore alimentare, farmaceutico, e industrie mediche [71]. Attraverso processi di gelazione termicamente reversibili, possono essere sintetizzati gli idrogel [51]. I materiali a base di Gellan sono stati recentemente proposti nella medicina rigenerativa, in particolare nell’ingegneria dei tessuti della cartilagine [72]. I problemi per la bioprinting sono rappresentati da una temperatura di gelificazione (> 42 ◦C) superiore alla temperatura fisiologica, che può compromettere la vitalità delle cellule e causa la perdita di stabilità e delle proprietà meccaniche [73,74]. La cellulosa, uno dei tanti polimeri presenti in natura, può entrare nella composizione del carbossimetile cellulosa e, a sua volta, idrogel [36], mediante processi specifici. Di recente, è stato testato per bioprinting della cartilagine [79,80]. La fibrina è una proteina del sangue, ben nota per il suo ruolo nella formazione del coagulo, che ne giustifica l’uso in ambito clinico come agente emostatico o sigillante. Gli idrogel possono essere preparati dal fibrinogeno dal trattamento enzimatico della trombina; i vantaggi sono eccellente biocompatibilità e biodegradabilità, ma deboli proprietà meccaniche [81]. Tuttavia, la loro combinazione con il particolato ECM può migliorare il potenziale condrogenico [36]. Polimeri sintetici biocompatibili già utilizzati per sviluppare idrogel per il tessuto cartilagineo ingegnerizzato, comprendono poli (vinil alcool) (PVA), PEG e pluronico [36,45]. Le loro proprietà possono essere progettate su misura in un modo più controllabile rispetto agli idrogel naturali; tuttavia, la loro idrofobicità possono compromettere la loro biocompatibilità [2,36,45]. La possibilità di fondere insieme gli idrogel naturali e gli idrogel sintetici potrebbe ridurre i problemi derivati da ogni singolo componente, superando i risultati ottenuti quando i materiali sono usati separatamente. Gli Idrogel a base di PVA e PEG sono stati sviluppati in una varietà di studi sui tessuti cartilaginei ingegnerizzati; tuttavia, il primo non è biodegradabile e può essere utilizzato solo per la cartilagine permanente impiantata [82,83]. È possibile invece utilizzare idrogel a base di metacrilato PEG (PEGMA)e di diacrilato (PEGDA) migliorato da un processo di cross-linking per indurre la differenziazione condrogenica MSC [84]. In un laboratorio è stato sviluppato un idrogel PEGMA che imita la struttura meniscale. Per aumentare la capacità di supporto strutturale, l’idrogel era reticolato UV e gli MSC erano incapsulati. La distribuzione cellulare omogenea e l’elevata vitalità cellulare sono state notate a seguito di processi di post-stampa, indicando le caratteristiche di biocompatibilità. Tuttavia, sono necessarie ulteriori ottimizzazioni per migliorare il proprietà meccaniche tipiche del menisco (Figura 2). I pluronici, noti anche come poloxameri, hanno proprietà tensioattive che consentono loro di interagire superfici idrofobiche e membrane biologiche [36,45]. Idrogel chitosano-pluronico termosensibile hanno dimostrato di essere in grado di supportare la crescita dei condrociti [85]. La loro combinazione con l’acrilato [35] consente lo sviluppo di un idrogel nanostrutturato che mostra le caratteristiche di stampabilità e, allo stesso tempo, una maggiore vitalità cellulare. Recentemente, il numero di studi si è concentrato sullo sviluppo di ponteggi a base di idrogel è aumentato e alcuni gruppi di ricerca hanno cercato di confrontare il loro potenziale di guarigione in termini di qualità di rigenerazione dei tessuti. Costantini et al. confrontando diversi ponteggi: GelMA, GelMA +condroitin solfato amino etil metacrilato (CS-AEMA) e GelMA + CS-AEMA + HA metacrilato (HAMA). Tutti gli idrogel sono stati combinati con l’alginato come agente templante per formare fibre stabili, stampato con MSC derivate dal midollo osseo umano e coltivato in terreno condrogenico per tre settimane. La presenza di collagene di tipo I, II, X e aggrecan è stata valutata qualitativamente, mediante immunocitochimica e quantitativamente mediante trascrizione inversa quantitativa in tempo reale. I risultati immunocitochimici non hanno mostrato differenze tra i tre ponteggi. Diversamente, le analisi RT-qPCR in tempo reale hanno dimostrato che il CS-AEMA si basa. L’impalcatura era il miglior candidato per migliorare la rigenerazione della cartilagine ialina esprimendo 6 volte più collagene di tipo II rispetto al collagene di tipo X. Diversamente, l’impalcatura a base di HAMA ha favorito la differenziazione delle MSC in un fenotipo ipertrofico con un’alta espressione di collagene di tipo X, predisponendo così all’insorgenza di OA [86]. Quest’ultimo risultato era conforme all’evidenziazione dei dati precedente che l’aumento della concentrazione di HA peggiora la qualità dei tessuti, con un chiaro spostamento verso l’ipertrofia materiale differenziazione degli MSC caricati. Daly et al. analizzato quattro idrogel comunemente usati, due naturali e due sintetici: agarosio, impalcature a base di alginato, GelMA e PEGMA. Dopo la semina con MSCs derivati dal midollo osseo e coltivando in un terreno condrogenico per quattro settimane, i bioink sono stati confrontati per la loro differenziazione potenziale verso la cartilagine ialina o il fenotipo della fibrocartilagine mediante studi in vitro. Risultati da questo lo studio ha dimostrato che gli idrogel di alginato e agarosio forniscono un buon supporto per sviluppare una forma ialina tessuto con un alto contenuto di collagene di tipo II, mentre sostenevano bioink a base di gelMA e PEGMA la formazione di fibrocartilagine, tipicamente composta da collagene di tipo I. Questi dati hanno fornito importanti approfondimenti clinici, poiché hanno dimostrato che diversi scaffold possono essere adatti a diversi applicazioni ortopediche e ha sottolineato l’importanza di selezionare il bioink corretto secondo le esigenze cliniche. In particolare, gli idrogel di alginato e agarosio sembravano adatti per l’articolazione in strategie di riparazione della cartilagine, mentre i bioink a base di GelMA e PEGMA sembravano essere indicati per il trattamento meniscale[88] (Figura 3).

ECM decellularizzato

il dECM può essere ottenuto dalla tripsinizzazione dei tessuti seguita da lavaggio. Tale procedura preserva i componenti dell’ECM, rimuovendo cellule, detriti e materiale immunogeno. Gli svantaggi di questa tecnica sono la presenza di residui chimici e un’importante perdita o danno dei componenti della matrice. Il dECM ottenuto può essere utilizzato direttamente per applicazioni di ingegneria dei tessuti mediante colonizzazione cellulare o ulteriore trattamento fino alla liofilizzazione in polvere per produrre idrogel [89].

Microcarriers

Si intende è una matrice polimerica con microsfere di dimensioni generalmente comprese tra 60 e 400 μm, la cui superficie funge da supporto per le MSC per formare aggregati multicellulari [90,91]. Superficie e composizione possono essere modificati per aumentare le proprietà di adesione o innescare la differenziazione delle cellule staminali. Nel lavoro di Levato et al., Microcarrier di acido polilattico carico di MSC (PLA) incapsulati in una gelatina è stato dimostrato che il bioink di gomma metacrilammide-gellano supporta la vitalità e la crescita cellulare durante bioprinting. È importante sottolineare che gli MSC sono stati in grado di differenziarsi verso fenotipi osteogenici e condrogenici, imitando così il compartimento osteocondrale

[92].

Sviluppi futuri

Per le sue caratteristiche, la bioprinting 3D ha avuto, sin dalla sua introduzione in campo medico, un grande impatto su ricercatori e clinici e ha anche suscitato numerose aspettative da parte dell’opinione pubblica. Tuttavia, questa tecnologia è ancora agli inizi e molti problemi devono essere affrontati prima della sua introduzione nella quotidiana pratica clinica, compresi ostacoli economici ed etici. Nel caso specifico della cartilagine, tale tessuto sembrerebbe più facile da stampare, a causa del suo spessore, l’avascolarità e la scarsa componente cellulare, soprattutto se paragonata ad altri tessuti incluso l’osso, che richiede la fabbricazione di una rete vascolare adeguata per la sua vitalità e l’attecchimento dei tessuti. Ulteriori studi preclinici in vitro e in vivo sono necessari per una applicazione clinica più rapida e per soddisfare le esigenze del paziente [92]. Per raggiungere questi obiettivi, sarà fondamentale il progresso finalizzato allo sviluppo di piattaforme innovative di tessuto biomimetico idoneo per approfondire i test in vitro ed un miglioramento delle prestazioni dell’impalcatura (ad esempio la produzione di materiali intelligenti con stampa quadridimensionale 4D )(Figura 4). Le cellule staminali sembrano essere delle buone candidate per la bioprinting della cartilagine a causa delle loro proprietà [11,12,93], ma ci sono alcuni limiti. Un problema importante è rappresentato dalla capacità rigenerative verso il fenotipo di cartilagine desiderato (ialino o fibroso), e quindi un tessuto funzionale. Ad esempio, le MSC mostrano la tendenza a progredire in un fenotipo ipertrofico e dando così aumento della formazione ossea endocondrale [11,12,93]. Pertanto, la ricerca di approcci più efficaci per evitare l’ipertrofia è impegnativo. Alla luce di queste considerazioni, riconosciamo la possibilità di utilizzare più tipi di cellule come un modo futuro valido per migliorare il processo di rigenerazione, che imita meglio la complessità strutturale e funzionale del tessuto cartilagineo. Infine, ulteriori miglioramenti nei dispositivi di stampa saranno obbligatori nel prossimo futuro per essere trasportabile in sala operatoria e facilmente utilizzabile dai chirurghi.

Piattaforme di tessuto biomimetico

L’integrazione della bioprinting 3D in un modello biomimetico o ingegneria organ-on-a-chip può facilitare la creazione di microrganismi o tessuti con caratteristiche specifiche. Queste strutture possono rappresentare strumenti adatti per i test in vitro o essere utili intermedi per l’ingegneria dei tessuti 3D [94]. Sono recentemente emersi modelli di tessuto biomimetico 3D che hanno iniziato a svolgere un ruolo importante nella scoperta e nello sviluppo di farmaci, riducendo così la necessità di test sugli animali. Un ruolo importante nella scoperta e sviluppo di farmaci, riducendo così la necessità di test sugli animali. Una sfida significativa è rappresentata proprio dalla capacità di progettare strutture complesse come i tessuti. Gurkan et al. Hanno sviluppato un modello in microscala che imita un tessuto di fibrocartilagine e la stampa di MSC umane con BMP-2 e TGF-β1. I risultati hanno suggerito la differenziazione simultanea. La tecnologia organo su chip promuove la formazione di strutture simili a tessuti o organi su una piattaforma di microchip. Tali sistemi possono essere sviluppati utilizzando il flusso di fluido dinamico per produrre nutrizione ossigenazione con segnali ambientali specifici del tessuto e gradienti molecolari. L’ ambientale è controllato: pH, temperatura, concentrazione di ossigeno e umidità. Un vantaggio di questa tecnologia è la possibilità di modificare meccanicamente o biochimicamente l’impostazione del chip, riproducendo così condizioni patologiche, come il degrado della cartilagine in OA. Questo potrebbe fornire comprensione della natura intricata delle malattie e dei loro trattamenti [69,96].

L’uso di più tipi di cellule

In generale, i tessuti mostrano eterogeneità in termini di tipi di cellule e distribuzione. La possibilità di creare tessuti utilizzando più tipi di cellule rappresenta una nuova opportunità in termini di biomimetica, superando anche i risultati ottenuti quando vengono utilizzati separatamente. In effetti, nonostante vari tentativi di generare cartilagine con condrociti o MSC usati singolarmente, recentemente la combinazione di entrambe le cellule è stato dimostrato che migliorano la condrogenesi. Nel lavoro di Apelgren et al., Mono- e co-colture di condrociti umani e le MSC derivate dal midollo osseo sono state stampate in un nano-fibrillato cellulosa (NFC) / alginato idrogel. I costrutti sono stati quindi impiantati per via sottocutanea in topi nudi e espiantato dopo 30 e 60 giorni per esami morfologici e immunoistochimici. Di conseguenza, sono state osservate una maggiore proliferazione e condrogenesi, rispetto ai costrutti che trasportano i due celle separatamente [99]. Möller et al. eseguito esperimenti simili, confermando precedentemente ottenuti risultati. Entrambi gli studi supportano l’ipotesi che il meccanismo associato all’effetto proliferativo delle cellule staminali sui condrociti è correlato alla segnalazione paracrina [100]. Levato et al. ha paragonato la capacità di produrre cartilagine in idrogel di multipotente a base GelMA cellule condroprogenitrici (ACPC) residenti in cartilagini articolari, MSC e condrociti. ACPC, principalmente situato nella zona superficiale della cartilagine articolare, può essere considerato interessante per il loro importante ruolo nello sviluppo dei tessuti, simile a quello delle MSC. I risultati hanno evidenziato che gli APC hanno mostrato il più basso livello di espressione genica del marker di ipertrofia collagene di tipo X e massima espressione di PRG4, un fattore chiave all’interno della zona superficiale coinvolta nella lubrificazione articolare. Tali dati hanno indotto il autori per creare costrutti di cartilagine bioprinted con MSC nello strato medio / profondo e ACPC su la superficie. L’analisi istologica ha confermato una differenza zonale nella distribuzione dei proteoglicani, dalla zona carica di ACPC alla zona carica di MSC, simile a quella della cartilagine articolare [101]. Nguyen et al. all’interno di cellule staminali pluripotenti indotte umane (iPSC) e condrociti ci sono due diverse composizioni NFC: alginato o HA. Bassa Proliferazione cellulare e pochi cambiamenti fenotipici sono stati osservati in seguito all’uso di NFC / HA. Nel caso di NFC / alginato, inizialmente era la pluripotenza veniva conservata, ma dopo cinque settimane hanno intrapreso un percorso di differenziazione, come dimostrato dalla formazione di aree di cartilaginee simili ialina e positive per il collagene di tipo II e prive di legame con l’espressione del fattore di trascrizione 4 octamer (4 ottobre). La proteina tumorigenica Oct4 può essere considerata come fattore primario di regolazione dell’auto- rinnovamento e di differenziazione. La sua riduzione è importante in ambito clinico perché indica la riduzione della pluripotenza, che aumenta il rischio di potenziale formazione di tumori [79].

Strumenti di bioprinting adatti in sala operatoria

Uno dei vantaggi maggiormente riconosciuti della stampa 3D in medicina è la produzione di prodotti su misura. Tuttavia, in questa fase, l’unica soluzione è creare il prodotto finale in il laboratorio e successivamente trasferirlo al paziente. Inoltre, per uso clinico, il bioprinted gli impianti devono soddisfare i requisiti di sicurezza e qualità [102]. Tuttavia, non ci sono molti sistemi automatizzati chiusi adatti a questo scopo. La maggior parte delle stampanti commerciali oggi lavora su

 un circuito aperto e non si hanno feedback sulla qualità della stampa, richiedendo quindi il monitoraggio da parte di esperti operatori [103]. Sono state dimostrate tecniche in situ affidabili, in cui il bioink è direttamente bioprintato nei siti di lesione nei modelli animali per il trattamento dei difetti ossei [104]. Tuttavia, durante l’applicazione nell’uomo, il dispositivo di stampa è ancora troppo ingombrante per essere utilizzato in un ambiente chirurgico. Un sistema di stampa che potrebbe essere utilizzato direttamente dal chirurgo eviterebbe passaggi di laboratorio e aggirerebbe la necessità di due interventi chirurgici, con una migliore conformità per il paziente e un recupero più rapido tempo [105]. O’Connell et al. Hanno pubblicato un recente lavoro che va nella direzione della traduzione della procedura del 3D di bioprinting in un processo chirurgico per la riparazione di difetti condrali. In particolare, hanno sviluppati uno strumento di fabbricazione portatile, chiamato “biopen”, che consente la deposizione attraverso ugelli personalizzati in titanio di un bioink composto da ASC umani e GelMa / HAMa in una procedura manuale di scrittura diretta. Gli esperimenti in vitro hanno dimostrato non solo che le cellule hanno mantenuto un’elevata vitalità (> 97%), ma anche che l’atto di bioprinting non ha suscitato alcun effetto visibile. Infine, gli autori hanno dichiarato che la fabbricazione dei parametri devono ancora essere ottimizzati, in particolare per quanto riguarda lo stress da taglio sperimentato dalle cellule durante il tasso di estrusione e lacitotossicità dovuta alla procedura di reticolazione [106]. Per superare questi e altre sfide, lo stesso gruppo ha migliorato lo strumento usando quello che hanno definito il principio core / shell di deposizione in ulteriori studi. In particolare, la penna è stata in grado di deporre un bioink composto da due componenti: un nucleo interno contenente ASC incapsulate in un idrogel GelMa / HAMa (10% / 2%) e un guscio esterno che porta lo stesso idrogel, ma reticolato. Il guscio indurito dotato di proprietà strutturali che consentono la stampa 3D mentre le cellule sono state conservate in modo relativamente morbido, in ambiente confortevole all’interno del nucleo. Secondo gli autori, questo approccio potrebbe aprire la strada all’uso materiali che sono preclusi in base ai loro problemi di tossicità intrinseca [107].

Conclusioni

La bioprinting 3D basata su impalcature che hanno il potenziale di riprodurre sia la cartilagine articolare che quella meniscale. I vantaggi dei metodi di fabbricazione convenzionali consistono nel controllo preciso dello spazio e dal design individuale. Tuttavia, diversi ostacoli devono ancora essere superati prima di raggiungere l’applicabilità clinica. In particolare, le sfide tecniche riguardano la formulazione e la tecnica del bioink, con suo miglioramento e standardizzazione. Nel caso della cartilagine, una sfida significativa è rappresentata dalla difficoltà ad imitare le proprietà meccaniche. Lo sono anche le cellule staminali, già dimostrate come mediatori preziosi per la rigenerazione dei tessuti candidati promettenti per questa tecnologia. Se associate a diversi biomateriali e fattori all’interno del bioink, sembrano mantenere la vitalità e migliorano il processo condrogenico. Il bioprinting 3D ha un grande impatto sull’opinione pubblica e solleva numerose aspettative. È auspicabile che ciò spinga positivamente l’attività di ricerca e quindi acceleri la sua applicabilità nella pratica clinica nel prossimo futuro.

Salvatore Vallefuoco

Antonio Izzo

Francesco Coppola